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牛呼吸道疾病（BRD）在兩周到六個(gè)月大的犢牛中很常見(jiàn)，是造成牛犢和飼養(yǎng)場(chǎng)牲畜死亡的主要原因（Johnson等，2011； Larsen）等，1999； Virtala等，1999）。 BRD涉及多種病原，包括牛呼吸道合胞病毒（BRSV），牛冠狀病毒（BCoV），3型牛副流感病毒（BPI3），溶血性曼海姆氏菌，多殺巴斯德氏菌，索氏嗜血桿菌和牛支原體（Angen等，2009； Frisis和Krogh，1983；Kusiluka et al。，2000; Larsen et al。，1999; Tegtmeier等，1999）。 牛皰疹病毒1（BoHV-1）和牛病毒性腹瀉病（BVDV）也可以是致病的病原，但是這些病原已在包括丹麥在內(nèi)的多個(gè)國(guó)家中被*。

在美國(guó)，超過(guò)90％的牧場(chǎng)會(huì)受到BRD的影響，據(jù)報(bào)道在中大型澳大利亞牧場(chǎng)中BRD的發(fā)生率為18.2％（Hay等人，2014）。 2014年，丹麥奶牛的估計(jì)死亡率為7-10％，而BRD被認(rèn)為是造成10-35％死亡的原因（Grønbæk等，2016）。在近的調(diào)查中，愛(ài)爾蘭研究中10％的小牛死亡率歸因于BRD，英國(guó)的BRD患病率為45.9％，發(fā)病率為10.1％（Johnson等，2017）。可以通過(guò)幾種策略來(lái)控制BRD，例如正確使用初乳（Pardon等，2015）或接種疫苗計(jì)劃（Richeson等，2008）。抗生素在BRD治療和控制中的廣泛使用（De Briyne等人，2014）是抗生素在經(jīng)濟(jì)動(dòng)物中的主要用途之一（Fulton，2009； Nickell和White，2010）。 BRD是與宿主易感性，環(huán)境條件，管理以及病原載量等多因素相關(guān)。感染會(huì)導(dǎo)致呼吸道發(fā)炎并損害呼吸道，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致死亡。發(fā)病機(jī)理被認(rèn)為是原發(fā)性病毒感染和隨后上皮細(xì)胞引起的細(xì)菌性繼發(fā)性感染（Angen等，2009; Sudaryatma等，2018）所致。病毒與免疫系統(tǒng)的相互作用會(huì)導(dǎo)致免疫抑制，從而削弱宿主對(duì)繼發(fā)性細(xì)菌感染的免疫反應(yīng)（Czuprynski等，2004）。 BRD的現(xiàn)場(chǎng)診斷基于臨床癥狀，臨床標(biāo)本的微生物學(xué)診斷適合多種樣本，例如氣管抽吸液，鼻拭子和肺組織樣本。然而，通常會(huì)遇到假陰性結(jié)果，因?yàn)榧?xì)菌可能是互相競(jìng)爭(zhēng)或生長(zhǎng)緩慢，并且可能其他細(xì)菌生長(zhǎng)更快（Bell等人，2014; Kugadas等人，2014; Shanthalingam等人，2014; Tegtmeier等人，2000）。盡管經(jīng)常使用諸如ELISA之類的血清學(xué)檢測(cè)方法來(lái)表明牛先前感染過(guò)牛分枝桿菌，但由于血清產(chǎn)生抗體通常需要兩周或更長(zhǎng)時(shí)間，因此在早期感染中會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果（Howard等人，1986; Petersen等人，2018）。已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了廣泛的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）分析方法來(lái)單獨(dú)測(cè)試BRD中涉及的每種病原（Amer等人，2013; Bell等人，2014; Klem等人，2019; Kishimoto等人（2017年； Rahpaya等人，2018年）。然而，對(duì)于單一靶向PCR來(lái)分別檢測(cè)多種BRD病原成本非常昂貴。為了克服這個(gè)問(wèn)題，近開(kāi)發(fā)了一種多重PCR檢測(cè)方法（Zhang等，2017）。盡管個(gè)別細(xì)菌或病毒可以單獨(dú)導(dǎo)致疾病，但混合性感染在BRD中常有放生。實(shí)現(xiàn)對(duì)這些病原的快速診斷對(duì)于實(shí)施適當(dāng)?shù)闹委熀涂刂拼胧┮仓陵P(guān)重要。常規(guī)PCR是有問(wèn)題的，因?yàn)樵诮】岛突疾〉呐僦卸伎赡艽嬖诓≡Ｔ诙喾N病原同時(shí)存在的情況下，臨床標(biāo)本中病原的定量檢測(cè)大大增加了微生物診斷的價(jià)值（Lima等，2016； Pedersen等，2014，2013）。

近，發(fā)表了一種用于檢測(cè)BRD相關(guān)細(xì)菌病原體的多重定量PCR（qPCR）方法，證明在與兩種或多種病原共感染時(shí)，其qPCR檢測(cè)性能優(yōu)于培養(yǎng)方法（Loy等人，2018）。DNA Diagnostic A / S公司為了提供一種可以快速檢測(cè)多種BRD病原方法，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了Pneumo 4多重病原qPCR檢測(cè)方法。Pneumo 4檢測(cè)試劑盒分Pneumo 4B（細(xì)菌）和Pneumo 4V（病毒）兩管檢測(cè)，可以分別快速地特異性地同時(shí)檢測(cè)和定量與BRD相關(guān)聯(lián)的四種細(xì)菌（溶血性曼海姆氏菌，多殺巴斯德氏菌，睡眠嗜組織菌Histophilus somni，牛支原體）和五種病毒（BPI3，BCoV，BRSV，BoHV-1和BVDV。對(duì)這9種病原的檢測(cè)可在同一反應(yīng)條件下分2管PCR反應(yīng)完成，與并行運(yùn)行的多個(gè)單重qPCR分析相比，診斷實(shí)驗(yàn)室在成本和處理時(shí)間方面具有優(yōu)勢(shì)。

Pneumo4B和Pneumo4V每次檢測(cè)分別能夠檢測(cè)10個(gè)拷貝的基因組DNA和10-50個(gè)拷貝的靶RNA，這與以前建立的報(bào)告每個(gè)反應(yīng)100-250個(gè)拷貝的方法具有可比性（Rahpaya等人，2018） 。 Pneumo4B檢測(cè)表明，許多氣管抽吸液（TA樣品）對(duì)溶血支原體，多殺性巴氏桿菌或沙門(mén)氏菌PCR呈陽(yáng)性，而通過(guò)培養(yǎng)方法呈陰性。這些結(jié)果表明存在細(xì)菌，但由于其培養(yǎng)基的傾向性或培養(yǎng)中其他細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)而無(wú)法被檢測(cè)到（Bell等人，2014; Van Driessche等人，2017）。Pneumo4B的PCR方法可能會(huì)克服伴隨的菌群的影響，并在傳統(tǒng)培養(yǎng)失敗的混合樣本中檢測(cè)到病原（Loy et al，2018）。確定Pneumo4B的診斷特異性和敏感性時(shí)，必須考慮將培養(yǎng)物作為參考標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法的局限性。如果Pneumo4B正確地鑒定了培養(yǎng)未檢測(cè)到的細(xì)菌種類，則Pneumo4B分析的特異性將被低估。如先前報(bào)道，少數(shù)樣品通過(guò)培養(yǎng)對(duì)細(xì)菌呈陽(yáng)性，而在Pneumo4B分析中呈陰性，證實(shí)qPCR可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果，如先前報(bào)道（Bell et al，2014）。對(duì)此的解釋可能是引物/探針錯(cuò)配，在儲(chǔ)存或處理過(guò)程中核酸降解或在提取過(guò)程中出現(xiàn)技術(shù)錯(cuò)誤。大多數(shù)培養(yǎng)陽(yáng)性/ PCR陰性樣品含有少量細(xì)菌，這可能是與用于培養(yǎng)的較大體積樣品相比，DNA提取樣品量較少的結(jié)果。但是，某些目標(biāo)細(xì)菌可能在引物或探針識(shí)別位點(diǎn)具有序列變異。 PCR抑制劑也可能導(dǎo)致了這些結(jié)果，因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)一些培養(yǎng)陽(yáng)性/ PCR陰性的樣品來(lái)自內(nèi)部擴(kuò)增對(duì)照（IAC）的PCR信號(hào)低得令人無(wú)法接受（無(wú)信號(hào)或Ct> 32），DNA提取物的5倍稀釋液并在重新測(cè)試后變?yōu)?span style="font-family:helvetica neue">PCR陽(yáng)性。但是，在我們的方法比較中，我們將此類樣品歸類為PCR陰性。與參考方法相比，通過(guò)Pneumo 4B進(jìn)行的牛支原體qPCR測(cè)試在氣管抽吸液（TA樣品）中檢測(cè)出更多陽(yáng)性。我們不能排除Pneumo 4B可能與其他支原體物種發(fā)生交叉反應(yīng)的情況，而在當(dāng)前的研究中尚未對(duì)此進(jìn)行測(cè)試。但是，在兩種方法均為陽(yáng)性的樣品中，Pneumo4B的結(jié)果比標(biāo)準(zhǔn)PCR的結(jié)果低3–4 Ct值，這表明該檢測(cè)方法對(duì)牛支原體的靈敏度比參考方法高。影響PCR擴(kuò)增效率的因素有很多，例如樣品的存儲(chǔ)和運(yùn)輸和DNA提取方法差異（Bowman等，2016; Dilhari等，2017）。

DNA Diagnostic A / S公司采用經(jīng)過(guò)國(guó)家獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的丹麥單重分析qPCR病毒檢測(cè)方案作為參考標(biāo)準(zhǔn)。與這些標(biāo)準(zhǔn)方法相比，Pneumo 4V多重檢測(cè)的靈敏度相同或稍高。某些樣本在Pneumo4V PCR中對(duì)BPI3，BCoV或BRSV呈陽(yáng)性，而在標(biāo)準(zhǔn)PCR中呈陰性。而只有一例標(biāo)準(zhǔn)PCR呈陽(yáng)性，而Pneumo4V呈陰性。這些陽(yáng)性樣品的Ct值為30以上。我們不能排除通過(guò)交叉污染或與本研究中未測(cè)試的其他病毒物種的非特異性擴(kuò)增可能產(chǎn)生高Ct的可能性。但是，丹麥養(yǎng)殖場(chǎng)的樣本上驗(yàn)證了Pneumo 4V的診斷敏感性和特異性有一個(gè)限制，因?yàn)榈湜](méi)有BoHV-1和BVDV病毒感染了。因此，無(wú)法評(píng)估BoHV-1和BVDV的診斷敏感性。在Pneumo 4V和標(biāo)準(zhǔn)PCR中，所有TA樣品的結(jié)果均確實(shí)對(duì)BoHV-1和BVDV陰性，表明在Pneumo 4V中對(duì)這兩種病毒的檢測(cè)與丹麥的其他牛呼吸道病毒沒(méi)有交叉反應(yīng)。對(duì)于在沒(méi)有BoHV-1 / BVDV的國(guó)家/地區(qū)常規(guī)使用，重要的是BoHV-1 / BVDV檢測(cè)方法必須具有高特異性，因?yàn)榧訇?yáng)性檢測(cè)可能會(huì)對(duì)監(jiān)管和貿(mào)易產(chǎn)生影響。需要進(jìn)行其他研究以評(píng)估Pneumo 4V對(duì)含有BoHV-1和BVDV的臨床樣品的敏感性。